在分子生物學實驗中，qPCR（實時熒光定量 PCR）技術以其高靈敏度、高特異性和快速性等優點，被廣泛應用于基因表達分析、病原體檢測等領域。然而，在實際操作過程中，實驗人員常常會遇到各種問題，影響實驗結果的準確性和可靠性。本文將根據常見問題及解決辦法，為大家詳細介紹 qPCR 實驗中的注意事項。

一、擴增曲線不光滑

擴增曲線不光滑可能是由于熒光信號太弱，經系統校正后產生。解決方法是確保 Mix 中預留的染料未降解；更換熒光信號收集更好的 qPCR 專用耗材。在實驗過程中，應選擇質量可靠的試劑和耗材，以保證熒光信號的穩定性和準確性。

Taq SYBR? Green qPCR Premix 是SYBR? Green I嵌合染料法專用qPCR試劑，為2×預混液，包含除引物和DNA樣品以外的所有qPCR組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是經抗體修飾的熱啟動Taq DNA聚合酶，配合精心優化的Buffer體系以及PCR反應促進因子，使產品具有特異性強、擴增效率高等特點，有效抑制非特異性擴增，可對寬廣濃度范圍的模板進行準確定量，獲得穩定可靠的qPCR結果。

　　預混液中含有獨特校正染料，與一系列 qPCR 設備兼容，包括需要 ROX 校正的儀器，實驗操作過程中不需要額外添加染料來校正儀器。

二、擴增曲線斷裂或下滑

當模板濃度較高，基線的終點值大于 Cq 值時，會出現擴增曲線斷裂或下滑的情況。此時，可以減小基線終點（Cq 值 - 4），重新分析數據。在實驗前，應合理估計模板濃度，避免過高濃度的模板對實驗結果產生不良影響。

三、個別孔擴增曲線突然驟降

如果反應管內留有氣泡，會導致個別孔擴增曲線突然驟降。為避免這種情況，應確保 Mix 完全溶解，請勿渦旋振蕩混勻；加樣完成后輕彈離心去除氣泡；延長預變性時間至 10 分鐘，以去除氣泡。在加樣過程中，要細心操作，盡量避免產生氣泡。

四、反應結束無擴增曲線出現

反應循環數偏少可能導致反應結束無擴增曲線出現。可以設置循環數為 40，但更多的循環數會增加過多的背景信號。在設置實驗參數時，應根據實際情況合理選擇循環數，以確保實驗結果的可靠性。

五、熒光信號采集步驟未設置或者設置錯誤

兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火&延伸階段，三步法擴增程序應當將信號采集設置在 72°C 延伸階段。在實驗前，要仔細檢查熒光信號采集步驟的設置，確保設置正確。

六、引物可能降解

長期未用的引物可能會降解，應先通過 AGE 電泳檢測完整性，以排除這種可能。對于長期未用的引物，在使用前應進行質量檢測，確保引物的完整性和有效性。

七、模板濃度過低

當模板濃度過低時，可以減少模板稀釋倍數重復實驗，在樣品濃度未知的情況下從最高濃度做起。此外，還可以嘗試其他方法，如提高引物濃度、優化 PCR 反應程序等，以提高實驗的靈敏度。

八、Cq 值出現過早

擴增效率低可能導致 Cq 值出現過早。解決方法包括提高引物濃度、嘗試三步法擴增程序或者重新設計引物。在實驗過程中，要不斷優化實驗條件，提高擴增效率。

九、模板降解

如果模板降解，應重新制備模板，重復實驗。在實驗過程中，要注意保存模板，避免模板降解。

十、擴增產物過長

擴增產物長度應控制在 80 - 200bp。過長的擴增產物可能會影響實驗結果的準確性。在設計引物時，要合理控制擴增產物的長度。

十一、體系中存在 PCR 抑制劑

一般為模板帶入 PCR 抑制劑，可加大模板稀釋倍數或重新制備高濃度的模板重復實驗。在實驗前，應對模板進行處理，去除可能存在的 PCR 抑制劑。

十二、空白對照出現信號

空白對照出現信號可能是由于反應體系污染。首先更換空白對照的水，如果還發生同樣情況，繼續更換引物、吸頭、PCR 管或啟用新的 Mix。反應體系應在超凈工作臺內配制，減少氣溶膠污染。在實驗過程中，要嚴格遵守無菌操作規范，避免反應體系污染。

十三、出現引物二聚體等非特異性擴增

一般在 35 循環以后空白對照出現擴增產物屬正常情況，應配合熔解曲線進行分析。重新設計引物，調整引物濃度，優化 PCR 反應程序，可以減少非特異性擴增。在設計引物時，要遵循引物設計原則，避免出現引物二聚體等非特異性擴增。

十四、熔解曲線出現多峰

熔解曲線出現多峰可能是引物設計不佳。根據引物設計原則重新設計新引物，可以改善熔解曲線的形狀。在設計引物時，要充分考慮引物的特異性和熔解曲線的形狀。

十五、引物濃度過高

適當降低引物濃度可以解決引物濃度過高的問題。在實驗過程中，要合理控制引物濃度，避免過高或過低的引物濃度對實驗結果產生不良影響。

十六、cDNA 模板存在基因組污染

提取后的 RNA 溶液使用 DNA 酶進行消化，例如：dsDNase，以去除基因組污染，或設計跨內含子引物。在實驗過程中，要注意去除 cDNA 模板中的基因組污染，以確保實驗結果的準確性。

 十七、實驗重復性差

加樣誤差大可能導致實驗重復性差。使用精準的移液器、配合高品質吸頭準確移液；高倍稀釋模板，加入大體積模板減少加樣誤差；放大 qPCR 反應體積等方法可以提高實驗的重復性。在實驗過程中，要嚴格控制加樣誤差，提高實驗的重復性。

十八、qPCR 僅不同位置的溫度偏差

定期校準 qPCR 儀可以解決 qPCR 僅不同位置的溫度偏差問題。在實驗過程中，要定期對 qPCR 儀進行校準，確保儀器的準確性和穩定性。

總之，在進行 qPCR 實驗時，實驗人員應熟悉常見問題及解決方法，嚴格遵守實驗操作規程，選擇質量可靠的試劑和耗材，以確保實驗結果的準確性和可靠性。

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